代謝工程通過定向改造微生物代謝途徑提升目標產(chǎn)物合成效率，而系統(tǒng)生物學則從全局視角解析代謝網(wǎng)絡的動態(tài)調(diào)控機制，二者的結(jié)合為L-精氨酸高產(chǎn)菌株的構(gòu)建與發(fā)酵性能優(yōu)化提供了系統(tǒng)性解決方案。以下從靶點挖掘、菌株改造、過程優(yōu)化三個層面闡述其協(xié)同應用。

一、基于系統(tǒng)生物學的代謝網(wǎng)絡解析：挖掘關鍵調(diào)控靶點

1. 全局代謝網(wǎng)絡建模與通量分析

通過基因組尺度代謝網(wǎng)絡模型（GEMs）重構(gòu)L-精氨酸合成相關的代謝網(wǎng)絡（以谷氨酸棒狀桿菌為例，涵蓋約800個反應和600個代謝物），結(jié)合 13C 同位素標記實驗（如 13C-葡萄糖追蹤碳流分布），量化各分支途徑的通量分配：

發(fā)現(xiàn)L-精氨酸合成的關鍵節(jié)點：谷氨酸→N-乙酰谷氨酸→鳥氨酸→瓜氨酸→精氨酸的線性途徑中，N-乙酰谷氨酸合成酶（NAGS）和精氨酸琥珀酸合成酶（ASS）為限速酶，其催化反應的通量僅為糖酵解途徑的15%-20%，存在明顯瓶頸；

識別冗余代謝分流：TCA循環(huán)中α- 酮戊二酸向谷氨酸轉(zhuǎn)化的通量占比不足40%，部分碳流通過乙醛酸循環(huán)流失（約 10%-15%），提示需強化谷氨酸合成以增加前體供給。

2. 轉(zhuǎn)錄組與代謝組關聯(lián)分析

通過比較高產(chǎn)菌株與野生型在發(fā)酵不同階段的轉(zhuǎn)錄組（RNA-seq）和代謝組（LC-MS/MS）數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)：

發(fā)酵中期（48 h），高產(chǎn)菌株中精氨酸操縱子（argCJBDF） 基因表達量上調(diào) 2-3 倍，而參與副產(chǎn)物（如脯氨酸、谷氨酸）合成的基因（proB、gdhA）表達量下調(diào)；

代謝物水平顯示，高產(chǎn)菌株中鳥氨酸積累量（2.5-3.0g/L）顯著高于野生型（<1.0g/L），但瓜氨酸向精氨酸的轉(zhuǎn)化效率較低（僅60%），提示ASS的活性或底物親和力需進一步優(yōu)化。

二、代謝工程的精準改造：基于系統(tǒng)生物學靶點的途徑優(yōu)化

1. 關鍵限速酶的定向進化與表達調(diào)控

針對 NAGS和ASS的瓶頸效應，采用易錯PCR構(gòu)建突變庫，結(jié)合高通量篩選（96孔板發(fā)酵+比色法檢測精氨酸）獲得高活性突變體：NAGS的Vmax 提升1.8倍，ASS對瓜氨酸的Km值降低40%，使精氨酸合成通量提高50%；

通過強啟動子（如 tac 啟動子）過表達突變型NAGS和ASS，同時刪除其反饋抑制相關位點（如NAGS的精氨酸結(jié)合域），解除產(chǎn)物對自身合成途徑的抑制，使發(fā)酵液中精氨酸濃度從30g/L提升至45g/L。

2. 碳氮代謝流的重分配

強化前體供給：過表達谷氨酸脫氫酶（GDH）和丙酮酸羧化酶（PC），將糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸更多導向草酰乙酸→α- 酮戊二酸→谷氨酸途徑，使谷氨酸積累量增加 25%，為精氨酸合成提供充足碳骨架；

減少副產(chǎn)物分流：敲除脯氨酸合成關鍵基因（proA）和谷氨酸脫羧酶基因（gadA），阻斷碳流向脯氨酸和 γ- 氨基丁酸的分流，副產(chǎn)物總含量降低 30%，碳源利用率從60%提升至75%。

3. 能量代謝與輔酶平衡優(yōu)化

L - 精氨酸合成需消耗大量 ATP（每分子精氨酸合成需4分子ATP），通過：

過表達ATP合成酶基因（atp operon），增強氧化磷酸化效率，使胞內(nèi)ATP/ADP比值提高1.5倍；

敲除NADH氧化酶基因（nox），減少NADH無效消耗，維持NADPH/NADP⁺比值穩(wěn)定（>2.0），為鳥氨酸合成中的還原反應提供輔酶，產(chǎn)率進一步提升12%。

三、系統(tǒng)生物學驅(qū)動的發(fā)酵過程動態(tài)調(diào)控

1. 基于代謝網(wǎng)絡模型的發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化

通過 GEMs 模擬不同碳氮比（C/N=3-5）、溶氧（20%-50%）和 pH（6.8-7.2）對精氨酸合成的影響，結(jié)合離線檢測（如胞內(nèi) ATP、NADPH濃度）與在線監(jiān)測（溶氧、pH、葡萄糖消耗速率），建立動態(tài)調(diào)控策略：

對數(shù)生長期（0-24h）：維持高C/N（5:1）和高溶氧（>40%），促進菌體生長（OD600達10-12）；

產(chǎn)酸期（24-72h）：降低C/N至3:1，溶氧控制在30%左右，同時通過流加尿素維持 pH7.0，減少能量消耗并定向推動碳流向精氨酸。

2. 應激響應機制的解析與緩解

系統(tǒng)生物學分析發(fā)現(xiàn)，高濃度精氨酸（>80g/L）會誘導菌體產(chǎn)生氧化應激（胞內(nèi)ROS水平升高2倍）和滲透壓應激（細胞膜完整性下降），通過：

過表達抗氧化基因（katG，編碼過氧化氫酶）和相容性溶質(zhì)合成基因（proU，編碼脯氨酸轉(zhuǎn)運蛋白），增強菌株對高濃度產(chǎn)物的耐受性；

優(yōu)化發(fā)酵后期溫度（從30℃降至28℃），減緩菌體衰老速度，延長產(chǎn)酸期8-12h。

四、多組學集成與合成生物學的未來方向

結(jié)合基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組的多組學數(shù)據(jù)，可構(gòu)建“基因型-表型”關聯(lián)模型，指導更精準的代謝工程改造：

利用 CRISPR-Cas9 技術進行多位點編輯（如同時調(diào)控arg operon、gdhA 和 katG），避免單基因改造的局限性；

引入動態(tài)調(diào)控元件（如基于精氨酸濃度的啟動子），實現(xiàn)關鍵酶表達的時空調(diào)控，減少代謝負擔；

結(jié)合連續(xù)發(fā)酵與原位產(chǎn)物分離技術（如膜分離），通過系統(tǒng)生物學模型優(yōu)化分離參數(shù)，進一步突破產(chǎn)物抑制瓶頸。

代謝工程與系統(tǒng)生物學的結(jié)合，通過“解析網(wǎng)絡-識別靶點-定向改造-動態(tài)調(diào)控”的閉環(huán)策略，顯著提升了L-精氨酸的發(fā)酵性能。未來需進一步強化多組學數(shù)據(jù)的整合分析能力，結(jié)合人工智能算法優(yōu)化代謝網(wǎng)絡模型，推動 L-精氨酸生產(chǎn)向高效、低耗、可持續(xù)方向發(fā)展。

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